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Nature
北京时间2025年3月13日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心范敏锐研究组与西湖大学吴旭冬团队、复旦大学张金儒团队及浙江大学苏楠楠团队合作，于国际权威学术期刊《自然》（Nature）发表了题为“Structure and mechanism of the plastid/
parasite ATP/ADP translocator”的研究论文，解析了叶绿体和衣原体ATP/ADP转运蛋白的高分辨率冷冻电镜结构，深化了人们对于叶绿体内共生过程中跨膜能量传递的分子机制的理解。
研究背景
众所周知，线粒体是真核细胞的动力工厂，生产生命活动所需的能量——ATP。在线粒体内膜上有一种被称为AAC的ATP/ADP转运蛋白，它可以将ATP从线粒体转运到细胞质基质为各种代谢活动供能，同时将ADP从细胞质基质转运到线粒体用于ATP合成。研究发现，植物细胞叶绿体（及其他质体，如合成淀粉的淀粉体等）内膜上也有一种被称为NTT的ATP/ADP转运蛋白，它的功能恰好与线粒体AAC蛋白相反，NTT可将ATP从细胞质基质转运到叶绿体为代谢活动供能，同时将ADP和磷酸根（Pi）从叶绿体转运到细胞质基质中（图1a）。相比于线粒体AAC蛋白，叶绿体NTT是已知的底物特异性最高的ATP/ADP转运蛋白，只能转运ATP/ADP而不能转运其它碱基种类核苷酸（如GTP/GDP、CTP/CDP等）和脱氧的dATP/dADP。研究表明，质体NTT在植物光合作用、淀粉合成及脂肪酸合成等物质和能量代谢过程中起重要作用。值得一提的是，硅藻中的NTT同源蛋白具有底物多样性，不仅可以转运细胞内的各种核苷酸，还可以转运人工设计的非天然核苷酸，在合成生物学领域有重要的应用。
有意思的是，在衣原体等专性胞内病原体（obligate intracellular pathogens）的细胞膜上也存在着类似于NTT的ATP/ADP转运蛋白，负责将宿主细胞的ATP转运到病原体细胞内为代谢供能（亦被称为能量寄生）（图1b），而一般的自生细菌（如大肠杆菌、蓝细菌等）则不具有这种NTT蛋白。如果蓝细菌没有NTT蛋白，而根据内共生理论叶绿体是由蓝细菌进化而来的，那么叶绿体的NTT蛋白从何而来呢？有猜想推测在内共生过程中，最初一个真核细胞同时吞噬了固氮蓝细菌和衣原体，由于固氮蓝细菌需要消耗大量的能量进行固氮，因此从衣原体通过基因水平转移的方式获得NTT这种转运ATP的膜蛋白，之后在进化过程中便一直保留下来，逐渐成为叶绿体和其他质体中不可或缺的一部分（图1c）。特别值得一提的是，最近有研究将NTT蛋白引入到蓝细菌中，在体外可以实现蓝细菌在能量代谢缺陷型酵母细胞内的共生，该共生体系统可存活达24代（图1d）。
图1. 叶绿体和专性胞内病原体ATP/ADP转运蛋白以及叶绿体的内共生过程和体外对内共生的人工模拟。图1c修改自Löffelhardt, 2013; 图1d修改自De et al, Nat Commun, 2024。
研究内容
为了求证叶绿体NTT蛋白的来源问题并阐明其识别和转运ATP/ADP的分子机制，范敏锐研究组与合作者利用冷冻电镜联合纳米抗体辅助，解析了来源于拟南芥叶绿体和肺炎衣原体的NTT蛋白的高分辨率三维结构（2.9 Å-2.7 Å）。其中拟南芥叶绿体NTT蛋白的三个结构分别处于外向开放态构象和结合底物（ATP或ADP加Pi）的内向部分开放态构象，肺炎衣原体NTT蛋白的两个结构分别处于外向开放态构象和结合底物（ATP）的内向开放态构象。结构显示NTT蛋白由12个跨膜螺旋组成，采取MFS（major facilitator superfamily）超家族的折叠模式，其中前6个跨膜螺旋组成N端结构域，后6个跨膜螺旋组成C端结构域（图2a）。拟南芥叶绿体和肺炎衣原体NTT的结构叠合显示两个物种来源差异巨大的蛋白质具有非常相似的三维结构（图2b），印证了植物叶绿体NTT蛋白来源于衣原体相应蛋白的猜想。
研究发现ATP分子（或ADP和Pi）的结合位点处于NTT蛋白的中央部分，位于N端结构域和C端结构域之间（图2c,d）。ATP的结合涉及其三个部分（腺嘌呤、核糖和磷酸）与NTT的大量相互作用，其中，ATP的腺嘌呤部分被夹在芳香族和疏水氨基酸残基之间，其带负电的磷酸基团则与周围带正电的氨基酸残基相互作用。ADP的结合位点与ATP类似，但是二者的构象有所差别，ATP的磷酸基团呈伸展的构象而ADP的磷酸基团呈折叠的构象，因此周围的互作残基也略有差别。有意思的是，研究发现Pi的结合位置正好对应ATP的γ磷酸基团的位置。为了验证结构上的发现，研究人员建立了基于化学发光的ATP/ADP交换实验以及基于放射性同位素的ATP-32P摄取实验，设计了一系列ATP/ADP结合位点的突变体，最终转运活性测定结果与结构上的发现相吻合。此外，研究人员还通过NTT蛋白热稳定性分析发现Pi可以显著促进ADP的结合，提示二者的结合具有协同效应，这与NTT的转运特性即ADP和Pi的共转运不谋而合。此外，研究发现如果将NTT中一个进化上非常保守的天冬酰胺残基（拟南芥AtNTT1中为N282）突变成丙氨酸，则其转运其他核苷酸（如GTP、CTP和UTP）的活性显著增加，提示该残基可能在NTT特异识别ATP中起重要作用。
图2 拟南芥叶绿体NTT（AtNTT1）的结构及其与肺炎衣原体NTT（CpNTT1）结构的对比，以及AtNTT1的ATP结合位点。
另一方面，通过对比已解析的叶绿体和衣原体NTT处于不同构象的结构，结合突变体和功能实验，研究表明NTT的N端结构域和C端结构域是两个相对刚性的部分，二者之间相对摆动，通过改变两个结构域之间的相互作用，来促进ATP或ADP加Pi的结合、跨膜转运与释放（图3），其转运机理符合MFS超家族的rocker-switch交替通路模型。
该研究不仅揭示了叶绿体和衣原体ATP/ADP转运蛋白NTT识别和跨膜转运底物的分子机理，加深了人们对于叶绿体内共生过程中跨膜能量传递机制的理解，也为改造NTT用于改良作物提高产量以及设计NTT抑制剂药物治疗专性胞内病原体引起的疾病提供了重要思路。
图3 NTT介导的跨膜ATP/ADP转运过程
相关信息
范敏锐研究员团队（从左到右：林华建，范敏锐，李天明，李文娟）
中国科学院分子植物科学卓越创新中心副研究员林华建、西湖大学博士生黄坚、分子植物卓越中心科研助理李天明和博士后李文娟为共同第一作者，分子植物卓越中心范敏锐研究员、西湖大学吴旭冬研究员、复旦大学张金儒研究员及浙江大学苏楠楠研究员为共同通讯作者。分子植物卓越中心博士生吴雨桐和杨天骄、博士后年宇薇、科研助理王睿瑛和赵晓慧，复旦大学硕士生林湘及浙江大学博士后王江勤也参与了该研究。感谢浙江大学、西湖大学和复旦大学冷冻电镜平台以及分子植物卓越中心公共技术服务中心的支持和帮助。感谢分子植物卓越中心同位素室徐乃旭和陈根云两位老师的大力帮助。该研究得到分子植物卓越中心、中国科学院先导科技专项、中国科学院上海分院和上海市“科技创新行动计划”的大力支持和资助。
专家点评
香港大学林文量教授
许多生物过程需要分解三磷酸腺苷(ATP)成 二磷酸腺苷(ADP) 和无机磷酸( Pi) 去驱动。为了迅速从 ADP 和 Pi 重新产生大量的 ATP 分子，大自然演化出 ATP 合成酶复合物。ATP 合酶是一种旋转分子机器，它利用质子（H⁺）梯度穿过膜来驱动 ATP 合成。ATP 合成酶存在于叶绿体和线粒体中, 因为它们有特殊的结构可以形成质子梯度去驱动 ATP合成。
线粒体是细胞的动力源泉，它能利用营养物质氧化产生的质子梯度在一天中持续不断地合成 ATP,通过线粒体 ATP/ADP 转运体输出到细胞质。第一个线粒体 ATP/ADP 转运体结构来自牛，于 2003 年解析。它采用桶状结构，由六个跨膜 α-螺旋组成，形成一个漏斗状空腔，其中包含一个底物结合位点。线粒体 ATP/ADP 转运体通过 “单结合中心 ”机制运行，在两种主要构象状态之间交替: 1. 细胞质状态（c-state）：向细胞质一侧开放，允许 ADP 从细胞质结合。2. 基质态（m-state）：向线粒体基质开放，向基质释放 ADP后结合 ATP 以输出。
因为叶绿体能够通过光合作用驱动叶绿体ATP合成酶去生产ATP，有些科学家认为叶绿体内合成的ATP能够好像线粒体一样 ，输出到细胞质。直到几年前利用 活体 ATP量度荧光蛋白才发现, 叶绿体内部消耗ATP的速度很快, 以致叶绿体内的ATP浓度低于 细胞质浓度。未成熟叶片的叶绿体必须从细胞质输入ATP, 因此叶绿体内膜也需要 一个ATP/ADP 转运体. 这个转运体的基因于2004年被发现, 但结构一直成谜。现在范敏锐研究组与合作者把这个叶绿体ATP/ADP转运体及同源的衣原体从宿主输入ATP的转运体同时解析出来,并通过一系列的实验验证了 ATP或ADP加Pi的结合位点、找出跨膜转运与释放的机理,该发现填补了这一领域一直以来的空白。除了科学发现外， 解析衣原体 ATP/ADP转运体结构也有开发新一代抗菌药物的应用潜力。
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