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大豆遗传转化是作物改良、功能基因组学和分子育种的关键工具。然而，传统方法受限于基因型依赖性、技术复杂性和严格的无菌要求。为了克服这些限制，东北农业大学韩英鹏团队和中国农业科学院和玉兵课题组联合开发了一种名为ROTIS：A RUBY-assisted One-shot Tissue-culture-free System for In-planta Soybean-transformation from Germinated Seedlings的遗传转化系统。该系统基于RUBY报告基因，利用萌发大豆作为外植体，在非组培条件下实现农杆菌介导的大豆转化，通过RUBY红色报告基因实现转基因筛选鉴定可视化，显著提升了转化效率和可扩展性。

方法创新：不限基因型，无需组织培养，简化流程

ROTIS系统的核心在于完全规避了复杂的组织培养步骤。实验使用细胞分裂素溶液处理大豆种子，在黑暗条件下在蛭石中培养萌发，子叶出土并转浅绿后，通过手术刀切主芽和侧芽，并利用在生长点制造规则的伤口，随后进行农杆菌浸染和真空渗透。共培养后，定期更换含抗性和诱导剂的棉球，诱导不定芽的形成和再生，通过对每个外植体连续切下伸长的再生苗，扦插至新蛭石中，最终筛选获得阳性苗。对于易转化品种，整个流程仅需40-60天左右即可获得转基因植株，且在同一个外植体上有机会产生多个独立转化事件。

RUBY红色可视化、多基因型适用性

RUBY报告基因由CaMV 35S启动子驱动。农杆菌侵染后，转化部位逐渐出现RUBY红色色素积累。在不定芽诱导阶段，新形成的阳性芽体呈现红色或随发育逐渐积累色素。叶片中红色主要出现在叶柄或叶脉，并随成熟加深；在白花品种中，RUBY表达导致花朵呈粉色；荚果中色素在节点和荚柄连接处明显；转基因种子表现为红褐色种皮和红色子叶，T1阳性种子发芽后幼苗整体呈深紫红色。值得注意的是，不同转基因株系表现出时空表达差异：有些株系在幼苗期颜色显著，随成熟减弱；有些则在全生育期保持均匀红色。

ROTIS系统在21个遗传多样性大豆品种中进行了测试，包括易转化品种东农50和主栽大豆品种如黑农48、黑农531等。这些品种的成熟期从95天到125天不等，具有不同的农艺性状（如花色、百粒重）。实验结果显示，农杆菌感染后5-8天，即观察到28.6%至64.3%的外植体出现RUBY红色，经筛选和诱导不定芽再生后，获得了黑农531、东农50、龙垦3092等不同基因大豆的RUBY转基因阳性株系。表明ROTIS系统具有广泛的基因型独立性，适用于多种基因型大豆。

稳定遗传：遗传分离与稳定表达

通过RUBY表型和PCR分析， RUBY转基因后代株系表现出稳定的孟德尔遗传（3:1分离比）。株系培养至T4代，未观察到基因沉默现象。定量RT-PCR显示Ruby和Gus转录本积累高度同步，尽管RUBY介导的甜菜红素积累可能受大豆宿主代谢调控，尤其是在发育过渡期。对于转基因大豆的分离和纯化，也可通过RUBY在植株和种子上的红色辅助鉴定。

ROTIS系统通过RUBY红色可视化实现了大豆遗传转化的简化和高效化。其无组织培养设计、多基因型适用性和稳定遗传特性，为大豆功能基因组学和分子育种提供了可扩展的平台。未来，可通过搭载不同抗性基因的载体进一步扩展系统应用。该方法不仅降低了技术门槛和成本，还为大豆遗传改良提供了新的应用工具。

该技术主要优势包括：

1）不依赖基因型:所有大豆品种皆可转化（育种品种以及南北方大豆转化周期有所差别）

2）极低嵌合率，交付T0代阳性植株，可稳定遗传至T4代以后，嵌合体率几乎为0

3）全国独家RUBY显色基因：转化事件肉眼可见，后代通过种子颜色即可筛选纯合材料

4）全国独家基因编辑载体自清除技术：T0代完全清除载体序列，育种周期缩短1–3年交付周期大幅提升：

5）转化周期最快3个月交付T0代植株，5个月交付T0代种子

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