本周六开讲！植物基因组编辑高级培训班~
通过基因组编辑技术修饰目标基因在农业应用中具有广阔前景。典型的基因组编辑使用位点定向核酸酶（site-directed nucleases SDNs），如成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced palindromic repeats CRISPR）相关蛋白9（CRISPR-associated protein 9 Cas9），在基因组特定位置产生DNA双链断裂（DNA double- strand breaks DSBs），进而通过修复过程中的错误引发DNA突变。通过SDNs进行的基因组编辑产生的突变可分为三类。SDN-1突变通常是通过非同源末端连接修复DNA时产生的短缺失或插入。SDN-2和SDN-3突变则通过同源定向修复实现，将外源DNA序列引入基因组。尽管携带SDN-1型突变的基因组编辑植物是通过转基因技术产生的，但只要其转基因成分已被分离，这些植物在许多国家并未受到严格监管，且社会接受度较高。因此，SDN-1基因组编辑对作物改良非常重要。目前已开发出许多SDN-1基因组编辑株系。然而，迄今为止开发的大多数SDN-1基因组编辑株系携带的是功能缺失突变，使得研究人员常常为基因编辑只能敲除基因而烦恼。
近日，日本广岛大学和高知大学的研究团队在《Plant Biotechnology Journal》在线发表了一项突破性研究成果“Promoter replacement by genome editing creates gain-of-function traits in Arabidopsis”，研究人员通过CRISPR-Cas9介导的染色体倒位，成功替换了拟南芥中两个基因的启动子，实现了“早开花”这一功能增益性状，且无需引入外源DNA。
同一染色体上的两个DSBs可能导致缺失或倒位，已有研究报道利用CRISPR-Cas9在植物中实现此类倒位。由于这种修饰不涉及外源DNA序列，因此被视为SDN-1型突变。大多数诱导倒位会导致功能缺失突变。然而，若倒位导致目标基因编码区与另一基因的启动子融合，则可能影响目标基因的表达，从而引发表型变化。
为验证这一可能性，研究人员尝试在模式植物拟南芥中通过靶向倒位替换同一染色体上两个基因的启动子。利用CRISPR-Cas9在转录起始位点附近引入DSBs。研究人员选择1号染色体上的开花位点T（FLOWERING LOCUS T，FT）作为目标基因。FT编码成花素，过表达会导致极早开花。作为启动子供体，选择了距离FT约3.6 Mb，两基因呈反向排列编码组蛋白H2A变体的HTA3基因。HTA3在多种幼嫩组织中表达，其功能缺失突变体表现正常生长。因此，若在两基因间包含其启动子的3.6 Mb片段发生倒位，将导致启动子交换，使FT受HTA3启动子调控。为此，设计了两个sgRNAs，分别在FT和HTA3的转录起始位点附近引入DSBs（图1a，b）。
在这一策略中，HTA3启动子与FT编码区（H-F连接）融合，而FT启动子则与HTA3编码区（F-H连接）融合。采用多重基因分型PCR检测H-F融合结构和F-F野生型结构（图1a，c，d）。对170个独立转基因株系的混合DNA样本进行PCR基因分型，发现其中一个包含6个单株的混合样本中存在H-F融合（图1d）。这6个单株中有一个显示H-F融合阳性信号（图1e）。我们从该植株收集种子，对14株植株进行H-F融合基因分型，并在短日照条件下观察其开花时间。所有携带至少一个H-F融合拷贝的个体均提前开花，而无H-F融合的个体开花时间正常。因此，H-F融合可遗传并与早花表型相关。
对H-F融合的PCR片段测序证实，HTA3启动子与FT编码区融合，并伴有9 bp缺失（图1b）。在F-H融合中，对应PCR产物的测序检测到FT启动子与HTA3编码区在预期断点位置精确融合。这些结果表明，该个体中发生了FT和HTA3之间3.6 Mb基因组片段的倒位；进一步通过全基因组测序验证了这一结果。因此，本实验中的倒位效率为0.65%。
通过将携带倒位的杂合植株与Col-0杂交，获得了无CRISPR-Cas9转基因的分离群体。尽管开花表型表现为半显性，但倒位存在与早花表型完全一致（图1g）。用包含倒位的基因组片段转化的Col-0植株表现出早花表型，证实倒位导致提前开花。
在短日照条件下，野生型中FT不被诱导表达，但在倒位纯合植株中FT表达水平较高（图1h）。因此，FT的异位表达可能是携带倒位植株早花表型的原因。RT-PCR表明，倒位株系中产生的FT转录本包含完整的编码序列。
在短日照条件下，所有无转基因的倒位纯合植株的开花时间与过表达FT的转化株一样早（图1i）。倒位株系的早花表型稳定遗传，而CaMV35S:FT植株的开花时间变异较大，部分植株开花时间与Col-0相近，表明转基因可能存在沉默现象。携带倒位的无转基因株系的生长和育性与野生型相当（图1j）。这些观察结果表明，本文提出的基因组编辑倒位系统可在不影响其他性状的情况下，引入具有稳定农业重要性状的功能增益突变。
本研究成功利用拟南芥中的SDN-1基因组编辑修饰了目标基因的表达，而此前主要通过创建转基因生物实现这一目标。该系统具有潜在的应用。例如，通过CRISPR-Cas9介导的倒位过表达除草剂靶标基因开发出抗除草剂水稻株系。除过表达外，通过选择合适的启动子，还可实现目标基因组织特异性或诱导性表达的修饰。结合其他技术（如诱导易位）的开发，可通过增加启动子的可用性扩展该系统的适用范围。此外，最近报道的在大肠杆菌中实现程序化重组的Bridge RNA系统也可整合到该系统中，为作物改良带来创新。
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.70123
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