近日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了由中国科学院东北地理与农业生态研究所冯献忠课题组及广州大学和华南师范大学合作团队撰写的“LRM3 positively regulates stem lodging resistance by degradating MYB6 transcriptional repressor in soybean”研究论文，揭示了U-box型E3泛素连接酶LRM3通过降解转录抑制子MYB6，解除其对于木质素合成关键基因PALs的表达抑制，进而增强大豆茎秆中木质素含量，茎秆机械强度和抗倒伏能力，这项研究为改良大豆抗倒伏性提供了重要的分子靶标。
大豆是全球重要的粮油作物，茎秆倒伏是限制大豆产量潜力发挥的重要因素，在密植条件下，倒伏可导致大豆12%-30%的产量损失。增强大豆茎秆的机械强度是提高其抗倒伏能力，实现大豆密植高产的重要育种目标。茎秆的强度主要来源于细胞壁的支撑，其中木质素作为一种重要的结构性大分子，赋予细胞壁硬度和稳定性，是决定茎秆抗倒伏能力的关键组分。但目前对于在大豆中调控木质素合成以增强茎秆强度的分子机制仍知之甚少。
中国科学院东北地理与农业生态研究所冯献忠团队和合作者揭示了LRM3通过精准调控茎部维管组织次生细胞壁中木质素沉积的时空模式，显著增强了大豆的抗倒伏性，该研究为大豆抗倒伏育种提供了新的理论依据。全文主要研究结果如下：
1. 鉴定并克隆了大豆抗倒伏关键基因LRM3
研究团队通过对大豆品种'Williams 82'(W82)进行EMS诱变，筛选到一个茎秆脆弱、易倒伏的突变体lrm3（lodging-related mutant 3）。该突变体在V7（第七片三出复叶展开）时期即表现出明显的倒伏表型，且单株荚数和产量显著低于野生型（图1a、1b）。通过图位克隆，将L其定位到第18号染色体上的Glyma.18G055200。序列比对发现，lrm3突变体在该基因的一个外显子处存在单碱基G缺失，导致移码突变和提前终止，形成截短的功能缺失蛋白（图1c）。将含野生型LRM3全长编码序列的过表达载体，导入lrm3突变体中，所有转基因互补植株均恢复为野生型表型，证实了LRM3基因功能丧失是导致lrm3突变体倒伏的直接原因（图1d、1e）。
图1调控大豆倒伏的LRM3基因克隆
2. LRM3通过调控木质素合成来影响茎秆强度
相较于野生型植株，lrm3突变体和LRM3基因敲除株系的木质素含量显著下降，降幅达70%至80%；而LRM3过表达株系中的木质素含量则呈现出约30%的显著提升（图2a、2b）。分析木质素单体组成发现，lrm3突变体中G型木质素和H型木质素含量显著降低，导致S/G比值改变（图2c-f）。LRM3基因功能缺失会导致G-木质素和H-木质素水平显著降低，并且改变了S/G木质素比率，最终使大豆茎秆强度下降。
图2LRM3通过调控木质素合成来影响茎秆强度
3. LRM3通过泛素-蛋白酶体途径降解转录抑制子MYB6
通过酵母双杂交筛选，鉴定到转录因子MYB6是LRM3的潜在互作蛋白（图3）。MYB6是大豆中一个R2R3-MYB类转录因子，与LRM3在体内和体外存在直接的物理互作（图3）；体外泛素化实验表明，LRM3具有E3泛素连接酶活性，能够在E1和E2酶存在下介导MYB6的多聚泛素化修饰（图3g）。MYB6-3×FLAG在lrm3突变体蛋白提取物中的降解速度明显更慢（图3h），而在LRM3过表达提取物中的降解速度更快（图3i），蛋白酶体抑制剂MG132能够显著抑制MYB6的降解（图3h、3i）。体内蛋白质降解实验证实，LRM3-GFP的共表达能够显著加速MYB6-LUC的降解，且该过程同样被MG132抑制（图3j）。这些证据表明，LRM3通过泛素-26S蛋白酶体途径介导MYB6的降解。
图3 LRM3与MYB6相互作用，通过26S蛋白酶体途径促进MYB6的降解
4. MYB6作为转录抑制子负向调控木质素合成基因PALs的表达
在W82中过表达MYB6，发现转基因植株表现出与lrm3相似的倒伏表型（图4a）。在lrm3背景下敲除MYB6（lrm3/myb6双突变体），其茎秆木质素含量显著高于lrm3单突变体，接近W82水平（图4b）。在茎秆木质化过程中（V3-V7期），LRM3的表达逐渐上调，而MYB6的表达则逐渐下调，二者呈负相关关系（图4c）。转录组（RNA-seq）分析比较了W82, lrm3和lrm3CR1的茎秆基因表达谱，发现苯丙烷生物合成途径在lrm3和lrm3CR1中显著下调（图4d、4e）。其中，木质素合成途径的关键限速酶——苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase, PAL）的两个基因PAL1 (Glyma.10G058200)和PAL2 (Glyma.03G181600)在突变体中表达显著下调。启动子分析发现PAL1和PAL2的启动子区域均含有MYB6结合位点（ACCTAC元件）。电泳迁移率变动分析（EMSA）和CUT&Tag实验均证实MYB6蛋白可以直接结合到PAL1和PAL2的启动子区域（图4f-i）。过表达MYB6显著抑制了内源PAL1和PAL2的表达（图4j、4k）。MYB6-GFP能够显著抑制由PAL1或PAL2启动子驱动的荧光素酶（LUC）报告基因的活性（图4l、4m）。综上证实MYB6直接结合并抑制PAL1和PAL2表达，负调控木质素合成。
图4. MYB6抑制苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因表达，下调木质素生物合成
5. pal1突变体验证了PALs在调控茎秆强度中的作用
为了确认MYB6通过抑制PALs表达导致倒伏的调控通路，分离出EMS诱导的pal1突变体（图5a、5b）。pal1突变体中PAL1基因第二个外显子上发生T→A碱基转换，导致苏氨酸被丝氨酸替换。相较于野生型W82，pal1突变体中的PAL酶活性出现了显著降低（图5c），且茎秆机械强度下降、木质素含量减少，与lrm3突变体表现一致（图5d、5e）。对成熟植株农艺性状评估显示，pal1突变体单株荚果数和粒重显著降低（图5f、5g）。木质素单体定量分析显示，pal1突变体中G-木质素、S-木质素含量及S/G比率明显下降，H-木质素水平不变（图5h-k）。
图5. pal1突变体负调控木质素合成及茎秆强度
6. 全文总结与展望
本研究了克隆大豆中调控茎秆强度和抗倒伏性的关键基因LRM3。LRM3通过介导转录抑制子MYB6通过泛素-26S蛋白酶体途径降解；MYB6的降解可以解除了其对下游木质素合成关键基因PAL1和PAL2的转录抑制；PAL1和PAL2基因上调表达促进了木质素的生物合成和在茎秆细胞壁中的沉积，从而增强了茎秆的机械强度和抗倒伏能力（图6）。
图6LRM3调控大豆木质素生物合成模式图
中国科学院东北地理与农业生态研究所博士研究生叶永恒与程志远副研究员为论文的共同第一作者，冯献忠研究员、杨素欣研究员与广州大学董志诚教授为共同通讯作者。研究得到国家自然科学基金（U21A20215和32488102），生物育种-国家科技重大专项（2023ZD0403201），吉林省科技发展计划项目(20230101166JC)联合资助。
论文链接：https://doi.org/10.1111/pbi.70124
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