近日，南京农业大学陈发棣教授团队在植物科学领域经典期刊Plant, Cell & Environment（中科院一区TOP期刊，5年影响因子7.6）上发表题为“CmBBX28-CmMYB9a Module Regulates Petal Anthocyanin Accumulation in Response to Light in Chrysanthemum”的研究论文。阐明了B-box蛋白CmBBX28响应光照和黑暗变化并通过CmMYB9a转录因子调控菊花花青苷生物合成和花瓣着色的新机制。
光照是影响菊花花瓣着色的关键环境因素。前人研究发现，遮光处理后菊花花瓣中的花青苷含量相比于对照组大幅减少，花青苷合成相关结构基因的表达显著下调（Hong et al., 2016, Plant Physiology and Biochemistry 103: 120-132），但其中的具体调控机制尚不清晰。在本研究中，作者发现课题组之前鉴定到的一个激活菊花花青苷生物合成的SG7 R2R3-MYB转录因子CmMYB9a（Wang et al., 2022, Plant Molecular Biology 108: 51-63）在光照下显著上调表达，可能参与光照调控菊花花青苷生物合成过程。作者以CmMYB9a为靶蛋白进行酵母双杂交筛库，筛选到一个B-box蛋白CmBBX28。酵母双杂交、Pull-down、BiFC和LUC互补实验均证实CmBBX28和CmMYB9a之间的相互作用。
图1. CmBBX28与CmMYB9a相互作用菊花瞬时遗传转化实验发现，CmBBX28负调控菊花花青苷生物合成结构基因CmCHS、CmDFR和CmUFGT的表达和花瓣中的花青苷积累。酵母单杂交实验发现CmBBX28不直接结合这些基因的启动子。课题组前期发现，CmMYB9a直接激活CmCHS和CmDFR基因的表达并间接上调CmUFGT的表达。作者通过竞争EMSA实验发现CmBBX28与CmMYB9a互作后破坏了CmMYB9a与CmCHS和CmDFR启动子的结合。qRT-PCR实验和LUC活性实验表明，CmBBX28不影响CmMYB9a的表达但负调控CmMYB9a的蛋白丰度，并因此下调CmUFGT的表达。菊花瞬时遗传转化实验证实，CmBBX28以依赖CmMYB9a的方式抑制CmCHS、CmDFR和CmUFGT的表达和花瓣中的花青苷积累。
图2. CmBBX28干扰CmMYB9a对下游靶基因启动子的结合相互作用
图3. CmBBX28负调控CmMYB9a蛋白丰度
图4. CmBBX28依赖CmMYB9a负调控菊花花瓣着色qRT-PCR实验和原核诱导蛋白半体外降解实验结果表明，CmBBX28的蛋白稳定性在黑暗处理和光照处理下没有显著差异，但其转录被黑暗处理显著诱导而被光照处理显著抑制。菊花中可能存在一个光照调控花瓣着色的新机制：黑暗在转录水平诱导CmBBX28，富集的CmBBX28蛋白与激活花青苷生物合成的CmMYB9a转录因子相互作用，一方面干扰其对下游花青苷合成结构基因启动子的结合，另一方面负调控其蛋白稳定性，进而抑制花青苷在花瓣中的积累；反过来，光照显著抑制CmBBX28的表达，并显著上调CmMYB9a的表达，从而促进花瓣中花青苷的合成。
图5. CmBBX28和CmMYB9a对光照和黑暗处理的响应
图6. CmBBX28-CmMYB9a分子模块参与光照调控菊花花瓣着色机制模式图 南京农业大学菊花遗传与种质创新团队青年教师周李杰、在读博士研究生彭家琳与已毕业硕士研究生陈楚文为本文共同第一作者，陈发棣教授为通讯作者。南京农业大学已毕业博士王艺光（现工作单位浙江农林大学）、王玉玺（现工作单位江苏开放大学）、南京农业大学宋爱萍教授、蒋甲福教授和陈素梅教授等参与了该项研究工作。该研究得到了国家自然科学基金面上项目（32372745）和海南省自然科学基金青年基金（322QN340）等项目的资助。
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