Abstract
摘 要
2024年10月7日， Molecular Plant在线发表了杜克大学董欣年教授实验室题为Next-generation mapping of the salicylic acid signaling hub and transcriptional cascade的研究文章，报道水杨酸信号转导枢纽中新组分的发现和相关信号转导途径的调控机制。
https://doi.org/10.1016/j.molp.2024.08.008
研究背景
在植物免疫研究中，水杨酸（SA）是一个关键信号分子，它在植物体内的系统获得性抗性中起着核心作用。SA通过激活NPR1蛋白来重新编程约20%的转录组，从而引发一系列的免疫反应。尽管NPR1在植物免疫中的重要性已被广泛认识，但其具体的分子机制仍然不完全清楚。
研究内容
为了深入理解NPR1如何调控免疫反应，作者采用了TurboID和绿色荧光蛋白标记的切割释放技术（greenCUT&RUN）来研究NPR1的信号网络和转录级联。为了探索SA结合后的NPR1如何与TGA复合物桥接并引发转录重编程，研究人员构建了表达NPR1-33HA-TurboID（NPR1-TbID）融合蛋白的拟南芥转基因植株，并使用LC-MS/MS质谱技术进行了无标记定量分析。在SA处理4小时后，鉴定到234个NPR1近邻蛋白（图1），这些蛋白在调控基因表达以及SA诱导的抗性中起关键作用，除某些转录因子外，大部分蛋白也存在于SA合成途径中关键蛋白GBPL3的近邻蛋白组中。
图1 NPR1 近邻蛋白中部分转录调控和染色质重塑蛋白也存在于GBPL3近邻蛋白组。
通过分析，研究人员发现NPR1-TbID捕获了几乎所有已知的NPR1相互作用蛋白，包括NPR3、NPR4、NIMIN1、TGA5和WRKY18等。这验证了TurboID方法的特异性，并证明了鉴定到的NPR1近邻蛋白主要集中在核内，可能包含NPR1增强体的组分，而非细胞质中的SA诱导NPR1凝聚体。在已知的NPR1相互作用蛋白之外，研究还鉴定出许多新的近邻蛋白。基于基因本体分析，这些蛋白富含与组蛋白修饰、染色质重塑、转录机械和RNA剪接复合体相关的功能，表明这些核功能模块参与了SA介导的转录组重编程。这些发现支持了NPR1作为中心信号枢纽的作用，它通过重塑染色质和调控基因表达来介导植物的广泛抗性反应。为了进一步验证新发现的NPR1近邻蛋白，研究者特别关注了两组蛋白：（1）染色质重塑蛋白，以BRM为代表；（2）组蛋白去甲基化蛋白，以LDL3为代表。实验表明，在SA诱导下，BRM和LDL3与NPR1的相互作用显著增加。此外，BRM和LDL3基因的敲除会部分削弱植物对病原体的抗性，而通过互补实验可以恢复这种抗性，表明它们在SA诱导的防御中发挥了关键作用。
图 2.NPR1 通过与 TGA TFs 结合靶向 TF 基因启动子。
NPR1已知可以与多种转录因子相互作用，包括TGAs和WRKYs。在这项研究中，研究者特别关注了WRKY54和WRKY70，因为尽管WRKY70已被证明与NPR1相关联，但其单突变体的转录影响相对较小。通过QuantSeq分析，研究发现WRKY54/70双突变体在SA诱导下的基因表达显著减少，且与野生型相比，突变体对SA的转录响应异常。这表明WRKY54和WRKY70在SA介导的转录重编程中起到重要的正向调控作用。
图 3.WRKY54/70 是 NPR1-TGA 下游的主要 TFs，可正向调节 SA 介导的基因表达和免疫抗性。
为了进一步探索NPR1的转录靶标，研究者使用了greenCUT&RUN技术对SA诱导下的NPR1进行分析。结果表明，NPR1主要结合在靶基因的启动子区域，且富集在TGA结合位点上（图2）。尽管NPR1和WRKY70共享了一部分靶标基因，但它们在不同的位点结合，表明NPR1通过与TGA转录因子结合，调控了SA响应基因的转录输出，而WRKY70则作为下游转录因子参与其中（图3）。
图 4.生物分子缩合物的形成稳定了 NPR1 与 TGA TF 的结合并增强了其转录活性。
最后，研究者通过实验验证了NPR1凝聚体的形成对于其染色质结合和转录活性至关重要（图4）。研究表明，NPR1在SA诱导下形成的凝聚体能够显著增强其与TGA转录因子的相互作用，从而提高转录活性。相比之下，突变体rdr3尽管积累在核内，但由于不能形成凝聚体，其染色质结合能力和转录活性显著降低。这一结果支持了NPR1凝聚体在SA信号传导中的重要作用。综上，研究人员通过TurboID无标记定量分析和greenCUT&RUN方法，系统鉴定了SA信号途径中重要组分NPR1的近邻蛋白和靶标基因。结果表明，NPR1与参与染色质重塑、组蛋白修饰及RNA剪接的蛋白质复合物相关联。此外，NPR1的直接靶标基因主要集中在启动子区域，并通过与TGA转录因子的结合实现其转录激活功能。研究还发现，NPR1通过形成核内凝聚体增强其染色质结合和转录活性。这些发现揭示了NPR1在SA诱导下通过分子复合体协调基因表达的机制，并进一步深化了我们对植物免疫调控网络的理解。
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