由病原菌Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）引发的柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing, HLB）已成为全球柑橘产业可持续发展的重大威胁，加速相关分子抗病育种研究迫在眉睫。然而，传统组织培养遗传转化方法存在成本高、效率低、操作复杂等技术瓶颈，加之嫁接或木虱传染HLB的抗病评价周期长等问题，限制了HLB相关抗病育种研究进程。开发高效稳定且可规避组织培养的遗传转化体系，对于加快抗病育种、抗病评价及其田间应用实践具有重要意义。
近日，赣南师范大学国家脐橙工程技术研究中心段硕团队在国际著名期刊Plant Biotechnology Journal（植物生物技术领域TOP期刊，IF=13.8）以Brief communication的形式发表了题为《Establishment and application of high-pressure propagation breeding (HPPB)-mediated genetic transformation system in citrus rootstocks》研究文章。该研究开发了一种基于高压繁殖法（High-Pressure Propagation Breeding，HPPB）的高效柑橘砧木遗传转化根系系统。通过发根农杆菌与高压繁殖盒相结合，HPPB实现了田间环境下快速获得遗传转化根系的技术流程。HPPB方法具有以下显著优势：（1）转化成本降低70%以上，因其无需无菌环境的组织培养和精细的温室管理投入，能够满足大规模砧木繁育与筛选的实验需求，同时适用于未来抗病砧木的快速育苗及田间应用；（2）结合HLB同步嫁接感染或在HLB病树上进行转化的策略，可将抗病砧木评价周期从常规的1-2年缩短至6个月；（3）通过绿色荧光蛋白（GFP）荧光标签或甜菜红素（RUBY）颜色标签，可实现遗传转化根系在田间环境下的快速筛选；（4）HPPB能直接移栽转化根系与地上部，实现“3月生根、6月成苗”的流程化操作，克服了团队此前发表的绕开组织培养的根系遗传转化方法《Highly efficient hairy root genetic transformation and applications in citrus》中存在较长童期问题，打破了抗病砧木从培育到田间快速扩繁应用的时间屏障。
图1 HPPB操作流程与部分应用示意图
Part I：HPPB操作流程图：a：HLB同步嫁接感染枝条示意图。b：获得具有遗传转化根系检测和移栽；Part II：不同柑橘砧木的HPPB转化示意图，c-e分别为枳Poncirus trifoliata(L.) Raf、来檬Citrus × aurantifolia(Christm.) Swingle和香橼Citrus medicaL.；Part III (f-h) HPPB遗传转化根系内CRISPR基因编辑结果；Part IV：24个CLas预测致病效应因子的HPPB转化示意图
研究团队系统评估了不同发根农杆菌菌株的转化效率，证实HPPB技术对多品种柑橘砧木的广适性。以发根农杆菌K599介导的香橼转化为例，对CLas的24个预测致病效应因子进行功能验证，HPPB技术实现91.62%生根率和85.62%转化效率，实验周期压缩至2-3个月。该体系不仅满足启动子分析、CRISPR编辑验证、激素检测等常规分子实验需求，更具备"一材多用"创新优势：单根转化枝条可同步开展多项目研究，且实验材料可循环利用，有效解决传统转化体系材料消耗大、资源利用率低的问题，显著提升珍稀柑橘种质利用效率。HPPB技术的建立不仅为柑橘抗病砧木遗传改良提供了抗病筛选评价手段，也为其它园艺作物遗传转化技术创新开辟了新视野。
图2 不同筛选标签（GFP/RUBY/GUS）在HPPB上的应用
图A：分析不同启动子组织特异性表达的质粒图谱与相应石蜡切片GUS染色分析结果；图B：柑橘遗传转化双元载体携带RUBY标签的质粒图谱与携带GFP/RUBY标签在田间实时鉴定展示结果。
该研究由赣南师范大学国家脐橙工程技术中心/江西省特色园艺植物病虫害防控重点实验室段硕副教授与李敏副教授为共同通讯作者，硕士研究生张斯羽为第一作者。研究获国家自然科学基金（32202272、32002021）及江西省杰出青年基金（原创探索类）项目
（S2023ZRYCL0074）、江西省双千计划项目（jxsq2020102132）等项目资助。
原文链接:https://doi.org/10.1111/pbi.70072
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