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The Plant Journal
川贝母是一种著名的传统中药材，来源于贝母属的几种植物的干燥鳞茎，具有多种药理活性，包括镇咳、祛痰、平喘等。由于其良好的药效，川贝母市场需求巨大。然而，川贝母的来源植物繁殖能力低，生长周期长，导致其供应有限且不稳定，因此价格高昂。且过度采挖导致野生资源减少，目前，所有贝母属植物均被列入中国国家重点保护野生植物名录。因此，如何满足大量的需求是川贝母应用和开发中的一个紧迫问题。异甾体生物碱被认为是川贝母的主要活性成分和特征性成分，具有止咳、祛痰、平喘等重要药理活性。在川贝母基原植物瓦布贝母（Fritillaria unibracteata var. wabuensis）中，西贝母碱苷（imperialine-3-β-D-glucoside）是含量最高的一种异甾体生物碱成分。但异甾体生物碱完整的生物合成途径尚不清楚。探索活性成分异甾体生物碱的生物合成途径能为缓解药用植物川贝母的资源短缺问题提供新的途径。
近日，四川大学生命科学学院张阳/付饶团队在《The Plant Journal》杂志上发表了题为“UDP-glucosyltransferases from UGT73 family catalyze 3-O-glucosylation of isosteroidal and steroidal alkaloids in Fritillaria unibracteata var. wabuensis”的研究论文。该研究鉴定出了异甾体生物碱和甾体生物碱下游合成途径的2个UGT73家族的UDP-葡萄糖基转移酶，可催化川贝母中异甾体生物碱和甾体生物碱的3-O-糖基化。
该团队首先构建了瓦布贝母的多组织（果皮、茎、叶和鳞茎）代谢组和转录组数据（图1），发现异甾体糖生物碱西贝母碱苷是不同组织间的主要差异代谢物，主要在鳞茎中积累，且是含量最高的甾体生物碱类化合物。西贝母碱（imperialine）的3-O-葡萄糖基化是西贝母碱苷生物合成的最后一步，通常由UGTs催化。通过系统发育分析和共表达分析，鉴定到了在体外酶活反应中能催化西贝母碱3-O-葡萄糖基化的西贝母碱3-O-葡萄糖基转移酶（FuwI3GT）。
图1 瓦布贝母体内异甾体生物碱和甾体生物碱的组织特异性积累
鉴于植物代谢酶普遍存在底物杂泛性，作者进一步验证了FuwI3GT是否能催化甾体生物碱茄啶（solanidine）的3-O-葡萄糖基化生成γ-卡茄碱（γ-chaconine），发现FuwI3GT确实显示出了阳性结果。进一步通过体外酶测定确定了FuwI3GT的酶动力学参数。然而，γ-卡茄碱主要在叶片和果皮中积累，与FuwI3GT的鳞茎高表达模式并不相同，暗示可能还有其他UGTs在叶片和果皮中催化γ-卡茄碱的生物合成。进一步的，同样通过系统发育分析和共表达分析，鉴定到了催化茄啶3-O-葡萄糖基化的茄啶3-O-葡萄糖基转移酶（FuwS3GT）。有趣的是，与能够利用西贝母碱和茄啶作为底物的FuwI3GT不同，FuwS3GT不能催化西贝母碱的3-O-葡萄糖基化。
FuwI3GT和FuwS3GT均含有组氨酸（H）和天冬氨酸（D）残基组成的催化二元体。H19的突变导致FuwI3GT和FuwS3GT的催化活性完全丧失，表明FuwI3GT和FuwS3GT具有保守的催化机制。在活性口袋中，FuwI3GT的色氨酸(W)和FuwS3GT的亮氨酸(L)在201位点存在显著差异。随后在FuwS3GT和FuwI3GT的201位点进行了氨基酸残基互换。将FuwS3GT中201位的亮氨酸突变为色氨酸（L201W），使其获得了催化西贝母碱的活性。相反，FuwI3GT中的W201L突变几乎完全消除了其对西贝母碱的催化活性。这些结果表明，201位的氨基酸对于底物特异性至关重要，其中W201对于催化异甾体生物碱起着关键作用（图2）。
图2 FuwI3GT和FuwS3GT活性的示意图
综上，该研究鉴定出两个UGT73家族的UDP-葡萄糖基转移酶，它们能够催化异甾体生物碱和甾体生物碱的3-O-葡萄糖基化反应：FuwI3GT可以利用异甾体生物碱西贝母碱和甾体生物碱茄啶作为底物，而FuwS3GT只能利用甾体生物碱茄啶作为底物。进一步研究发现：FuwI3GT中的W201残基决定了其对异甾体生物碱的催化能力。FuwI3GT和FuwS3GT的鉴定揭示了异甾体生物碱和甾体生物碱合成途径中的一个步骤；FuwI3GT的发现为川贝母异甾体生物碱完整生物合成途径的鉴定奠定了基础。在后续的研究中，该基因可以作为诱饵进行共表达分析，以筛选更多的候选基因；FuwI3GT是首个报道的能够催化川贝母中主要的生物碱-瑟文型异甾体生物碱糖基化的基因，从而扩大了我们对糖基转移酶功能的认识；发现FuwI3GT的W201残基是决定异甾体生物碱底物催化能力的关键位点，成功地赋予了正常甾体生物碱UGT （FuwS3GT）催化异甾体生物碱的能力，为通过工程策略改变酶-底物特异性提供了有价值的见解。
四川大学生命科学学院博士研究生王晶金为论文第一作者，张阳教授和付饶副研究员为共同通讯作者。四川大学生命科学学院唐琳教授、质谱平台王晞华博士和四川大学华西药学院叶本贵副教授也参与指导了本项工作。本研究得到了国家自然科学基金、四川省自然科学基金创新研究群体等经费的支持。
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