近日，中国农科院油料所王汉中院士/湖北洪山实验室课题组在Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了题为“An alternative splicing caused by a natural variation in BnaC02.VTE4 gene affects vitamin E and glucosinolate content in rapeseed (Brassica napus L.)”的研究论文。该研究工作通过不完全双列杂交揭示了油菜种子中维生素E（VE）的含量主要受胚基因型调控，并利用全基因组关联分析、遗传互补、定点诱变等技术手段克隆出目标基因BnaC02.VTE4，发现其第二个内含子3'剪接位点上A到G的碱基变异是导致油菜籽VE和硫代葡萄糖苷（硫苷）含量差异的直接原因，结合转录组和代谢组联合分析揭示了BnaC02.VTE4正向调控VE和负向调控硫苷含量的分子机制，并证明优异单倍型BnaC02. VTE4HapH可以实现油菜籽高VE和低硫苷改良的育种目标，为油菜品质性状的综合改良提供了基因资源及理论基础。VE是一种对于动植物的生长发育至关重要的脂溶性营养素，无法在非光合生物中自主合成，膳食来源的VE摄入是保障人体营养健康的关键。VE广泛分布在高等植物的不同组织中，其中油料作物种子中的VE含量最为丰富（Gilliland et al., 2006）。油菜是世界第三大油料作物，也是中国最大的油料作物。与花生和大豆相比，菜籽油富含α-T（Matthaus et al., 2016）。此外，将油菜籽中的硫苷含量降低到30μmol/g以下, 可大幅度地提高饼粕的饲用价值。高VE、低硫苷是油菜品质育种的重要方向，发掘调控油菜种子VE和硫苷合成的关键基因，对于油菜籽品质育种具有重要意义。中国农科院油料所/湖北洪山实验室王汉中院士团队通过GWAS分析和油菜、拟南芥中的遗传互补实验揭示了BnaC02.VTE4基因是调控油菜籽粒中VE含量的主效基因。在自然群体中，BnaC02.VTE4的单碱基突变导致的可变剪切产生了两种功能缺失的转录本，阻碍了γ-生育酚（γ-T）向α-T的转化，从而影响了VE的积累，并在代谢通路上显著影响了硫苷生物合成途径，这使得BnaC02.VTE4在正向调控油菜籽粒VE的同时负向调控了硫苷含量。
图1 目的基因BnaC02.VTE4功能变异位点鉴定研究者在目的基因BnaC02.VTE4的HapL单倍型中鉴定到2种长度不同于HapH单倍型的转录本，HapL-T1和HapL-T2（图1a），序列分析发现BnaC02.VTE4第二个内含子3'剪接位点即1052bp处由A到G的碱基变异，导致HapL单倍型产生2种可变剪切转录本（图1b），这两种转录本均产生了翻译提前终止，导致BnaC02.VTE4关键功能结构域Ubie_methyltran的缺失（图1c），将HapH和HapL的3个转录本，HapH-T及HapL-T1和HapL-T2同时转入拟南芥突变体atvte4-4，结果表明HapH-T可恢复atvte4-4的VE含量至野生型表型，而HapL-T1和HapL-T2均不能使atvte4-4的VE积累能力提高（图1d）。将HapH.gDNA的1052bp处由A突变为G，将HapL.gDNA的1052bp处由G突变为A，将点突变后的全长载体分别转入拟南芥突变体atvte4-4及HapL单倍型油菜8S088，结果表明定点诱变后的HapH全长不再具备提高拟南芥突变体及HapL单倍型油菜中VE含量的功能，而定点诱变后的HapL全长能显著提高atvte4-4及8S088转基因植株的VE及α-T积累量（图1e、f）。以上结果表明，BnaC02.VTE4第二个内含子3'剪接位点即1052bp处由A到G的碱基变异产生的可变剪切和翻译提前终止，是导致油菜籽粒VE含量变异的关键原因。研究者对BnaC02.VTE4基因的不同单倍型油菜的关键发育阶段籽粒（授粉后4W和6W）进行了转录组和代谢组分析，结果表明VE合成通路的基因在HapL油菜籽粒中显著下调，而硫苷合成通路基因及代谢物在HapL油菜中显著上调（图2a、b、c、e），对VE合成通路及硫苷合成通路的主要基因进行定量分析，结果与转录组一致，在HapL油菜中VE合成通路部分关键基因如BnaC06.VTE3 and BnaC09.VTE5显著下调，而硫苷合成通路大量关键基因如BnaA04.CYP83A1、BnaC04.CYP83A1、BnaC04.MAM1、BnaA05.leuC、BnaC04.leuC、BnaC08.P45083B1、BnaA06.CYP79F1和BnaA09.UGT74B1及BnaC05.UGT74B1显著下调（图2d），对授粉后4W和6W籽粒硫苷含量进行测定，结果表明HapL籽粒硫苷含量显著高于HapH（图2f），对油菜关联群体及BnIR数据库中广泛来自全球各地的油菜进行分析，发现各资源群体中HapL的籽粒硫苷总量均显著高于HapH（图2g、h），而8S088及8S100的BnaC02.VTE4HapH互补株系籽粒硫苷总量较野生型显著降低（图2i）。这些结果表明，BnaC02.VTE4正向调控油菜种子中VE和负向调控硫苷生物合成。
图2 BnaC02.VTE4HapH 及 BnaC02.VTE4HapL种子的转录组和代谢组分析在以上研究结论下，研究者提出了BnaC02.VTE4正向调控VE和负向调控硫苷含量的分子机制作用模型（图3）。BnaC02.VTE4的优势单倍型HapH正常翻译后上调了VE合成通路，使底物络氨酸和蛋氨酸更多的合成α-T，从而增加了油菜籽粒中的VE积累（图3a），而HapL在1052bp发生单碱基由A到G的突变后，缺失了关键功能结构域Ubie_methyltran，从而抑制了VE合成通路，使硫苷合成通路整体上调，底物络氨酸和蛋氨酸更多的流向了硫苷合成，从而增加了籽粒中硫苷含量（图3b）。本研究阐明了VE与硫苷生物合成通路的底物竞争关系，从而揭示BnaC02.VTE4正调控VE和负向调控硫苷生物合成的分子机制。
图3 BnaC02.VTE4同时调控油菜籽粒VE和硫苷生物合成的作用机制模型图这项研究通过全基因组关联分析、遗传互补、定点诱变等手段克隆调控油菜VE合成的目标基因BnaC02.VTE4，并证实位于BnaC02.VTE4第二个内含子3'剪接位点上A到G的碱基变异，导致的可变剪接和翻译提前终止，是油菜群体中籽粒VE和硫苷的含量差异的直接原因。通过转录组和代谢组联合分析，研究阐明了VE与硫苷生物合成通路对底物的竞争关系，从而揭示了BnaC02.VTE4正调控VE和负向调控硫苷含量的分子机制，证明优异单倍型BnaC02. VTE4HapH可以帮助油菜籽实现高VE和低硫苷综合改良的育种目标。中国农科院油料所在读博士、天水市农科所助理研究员王芙蓉为论文第一作者，中国农科院油料所/湖北洪山实验室王汉中院士、中国农科院油料所顿小玲研究员为论文共同通讯作者。中国农科院油料所/湖北洪山实验室王新发研究员、中国农科院油料所匡列琼助理研究员、田泽助理研究员、硕士研究生肖泽琳共同参与完成了该研究工作。该研究得到青海省帅才科学家负责制项目、中央公益性科研院所基本科研业务费、中国农业科学院科技创新工程、现代农业产业技术体系的支持。 论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14603References:[1] Gilliland, L. U., Magallanes-Lundback, M., Hemming, C., Supplee, A., Koornneef, M., Bentsink, L., and Dellapenna, D. (2006) Genetic basis for natural variation in seed vitamin E levels in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103(49), 18834–18841.[2] Matthaus, B., Özcan, M. M., and Al Juhaimi, F. (2016) Some rape/canola seed oils: Fatty acid composition and tocopherols. Zeitschrift Fur Naturforschung. C, Journal of Biosciences 71(3–4), 73–77.
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