番茄是一种重要的园艺作物，番茄果实在成熟过程中果实细胞中的质体发生转变，即叶绿体转化为有色体，果实颜色由绿色转变为红色。质体是具有独立基因组的半自主性细胞器，质体的分裂和转变需要细胞核和质体的协同调控。因此，质体-细胞核逆向信号（retrograde signal）有可能调控番茄果实成熟进程，然而由于缺乏合适的番茄逆向信号突变体，该假说一直没有得到证实。
近日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了由上海交通大学尹若贺课题组与合作者团队撰写的“Characterization of a tomato chlh missense mutant reveals a new function of ChlH in fruit ripening”研究论文，首次揭示了质体蛋白SlChlH（GUN5）在调控番茄果实成熟中的作用机理。为了调控质体的功能，质体和细胞核之间需要进行信号交流，包括细胞核向质体的正向信号（anterograde signal）以及质体向细胞核的逆向信号（retrograde signal）。编码质体定位的光合相关蛋白的细胞核基因（photosynthesis-associated nuclear genes，PhANGs）是质体逆向信号的靶基因。前人研究表明，当质体功能紊乱时，质体蛋白介导的质体逆向信号抑制PhANGs的转录。研究人员利用类胡萝卜素生物合成抑制剂Norflurazon（Nf）处理拟南芥突变体幼苗，破坏质体发育并探测PhANGs的表达水平，共筛选到6个GENOME UNCOUPLED（GUN）位点，它们对应的突变体表现为Nf处理后PhANGs的转录抑制不完全。其中，GUN5位点对应叶绿素生物合成关键限速酶镁鳌合酶的催化亚基ChlH的编码基因。ChlH（GUN5）介导的质体逆向信号在拟南芥中参与幼苗期叶绿体发育（质体由前质体或黄质体向叶绿体转变）和响应温度胁迫等过程。模式植物的研究大多数都集中在幼苗发育阶段，其在生长发育后期的功能研究比较欠缺。GUN蛋白在作物中的功能研究比较滞后，尤其是农作物果实发育中的功能尚未见报导。该研究获得了一个由EMS诱变产生的叶绿素缺失突变体mut26，它除了产生植株失绿表型外，还阻断了苗期Nf介导的质体逆向信号。基因定位和构建功能回补株系（#6）等相关结果表明SlChlH的一个单碱基突变，导致一个氨基酸替换（SlChlHP398S），是mut26产生植株叶绿素缺失和苗期质体逆向信号受阻表型的主要原因（图1）。由于mut26是一个质体逆向突变体，按照拟南芥的命名方法，mut26 是第一个被报导的番茄gun5突变体。
图1 失绿突变体mut26是番茄质体逆向信号突变体gun5
有趣的是，SlChlH的蛋白和转录本在番茄果实从绿熟期（Mature Green，MG）到破色期（Breaker，Br）被显著诱导，在破色后3天（Br+3）达到峰值，在破色后6天（Br+6）开始下降。绿熟期向破色期的转变是番茄果实成熟的标志，上述结果暗示SlChlH调控果实成熟。进一步，该研究通过标记果实的花后时间（day post-anthesis，dpa）表明，野生型和mut26果实均在35 dpa时到达绿熟期，但mut26推迟了后续的成熟进程。具体表现为mut26果实在成熟开始后乙烯释放量下降，叶绿体向有色体转变的速度减缓，成熟后期（44 dpa）类胡萝卜素的含量降低等，并且上述表型在恢复系（#6）中被恢复（图2）。综上，SlChlH正调节番茄果实成熟进程。
图2 mut26推迟了番茄果实成熟进程
番茄果实从绿熟期向破色期和红熟期的转变进程，对应质体从叶绿体转变为有色体。为了进一步明确SlChlH介导的质体逆向信号是否参与上述进程，该研究对WT和mut26的绿熟期（35 dpa）和破色期（38 dpa）果实进行转录组分析，结果表明野生型番茄果实从绿熟期向破色期转变过程伴随着SlPhANGs的转录抑制和多个已知成熟基因（乙烯生物合成和信号转导、类胡萝卜素生物合成、果实软化和成熟正调节转录因子等）的转录激活，但是上述基因的转录变化在mut26中被抑制（图3）。因此，该研究认为SlChlH（GUN5）正调节番茄果实成熟进程可能通过其介导的质体逆向信号实现。
图3 SlChlH介导的质体逆向信号促进番茄果实成熟
为了进一步研究SlChlH（GUN5）如何在转录水平调控番茄果实成熟，该研究探测了转录因子SlHY5的功能。前人研究推测拟南芥HY5位于ChlH（GUN5）介导的质体逆向信号下游，但由于拟南芥HY5和ChlH位于同一条染色体上且物理距离较近，暂无双突变体进行遗传学分析。番茄SlChlH和SlHY5不在同一条染色体上，该研究通过杂交的方式构建双突变体mut26 Slhy5。mut26 Slhy5表现出比单突变体更明显的叶片黄化表型，塑料大棚种植时无法坐果，因此无法调查田间果实成熟表型。该研究进一步利用苗期Nf处理探测mut26 Slhy5的质体逆向信号表型，结果发现Nf处理后，Slhy5突变体表现出和WT一样的SlPhANGs转录抑制，表明Slhy5并不是gun突变体；双突变体mut26 Slhy5消除了mut26的gun表型，表现为与WT、Slhy5一致的SlPhANGs转录抑制，表明SlHY5位于SlChlH（GUN5）介导质体逆向信号下游调控SlPhANGs的表达（图4）。因此，该研究推测在果实成熟开始后，SlChlH介导的质体逆向信号与苗期Nf处理类似，即通过SlHY5依赖的方式抑制SlPhANGs表达
图4 SlHY5位于SlChlH介导的质体逆向信号下游
前人研究表明番茄SlHY5促进果实成熟进程，表现为缩短了果实从盛花期到达绿熟期的时间，但是SlHY5是否参与调控果实从绿熟期到破色期和红熟期的进程尚不清晰。进一步，该研究利用实验室前期构建的移码突变体Slhy5，通过标记并比较相同状态（绿熟期、破色期、破色后3天和破色后6天）果实的成熟表型，结果表明Slhy5虽然降低了成熟后期（44 dpa）果实类胡萝卜素的含量，但并没有改变乙烯释放量和成熟相关基因的转录水平（图4）。因此，该研究认为Slhy5并不影响果实从绿熟期向破色期和红熟期的转变，这可能与Slhy5在Nf处理后不是gun突变体有关。值得一提的是，Slhy5与mut26类似，均表现为叶片和果实的失绿表型，但它们的成熟表型却显著不同，暗示突变体株系中叶绿素含量下降没有影响果实成熟进程。 果实从绿熟期向红熟期转变时，SlChlH的蛋白和转录本大量积累。考虑到SlHY5缺乏转录激活结构域，需要结合辅因子实现对靶基因的调控，因此该研究提出假定工作模型如下：SlChlH介导的质体逆向信号一方面通过抑制SlHY5的辅因子Y，导致SlHY5无法正调节SlPhANGs转录，同时通过其它信号元件（如：细胞质热激蛋白HSP90或其它未知元件）抑制SlPhANGs转录；另一方面SlChlH通过SlHY5不依赖的方式诱导成熟相关基因的表达 （图5）。未来的研究需要进一步弄清果实成熟过程中GUN5如何产生并传递质体逆向信号入核，以及位于GUN5下游的关键转录因子调控乙烯合成和果实成熟等。
图5 SlChlH（GUN5）介导的质体逆向信号调控番茄果实成熟模式图
上海交通大学在读博士生许达为和林丽副研究员为论文的共同第一作者，尹若贺长聘副教授为论文的通讯作者。上海交通大学武国章长聘教轨副教授和万兵兵长聘教轨副教授，浙江大学喻景权院士，瑞士日内瓦大学Jean-David Rochaix教授，德国柏林洪堡大学Bernhard Grimm教授等参与了本课题研究工作。该研究得到了国家自然科学基金、上海市自然科学基金、海南省种业实验室和中种集团联合揭榜挂帅项目以及上海交通大学项目的资助。原文链接： http://doi.org/10.1111/pbi.14548
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